周海媚於1985年參選港姐，雖未能晉身決賽，但被TVB邀入無綫電視藝員訓練班第1期藝員進修班，甫出道即參演同年台慶劇《楊家將》。
80年代中後期，周海媚參與多部劇集演出，包括《流氓大亨》等，直至1989年《義不容情》爆紅，成為TVB當紅花旦。1994年周海媚在劇集《倚天屠龍記》飾演周芷若，紅遍中、港、台，被封為「最美周芷若」，也是其演藝生涯中最具代表性的角色。
1996年周海媚曾赴日發展，並拍攝大尺度內衣寫真照，及與永瀨正敏拍攝手機廣告受到注目。1997年周海媚於《大鬧廣昌隆》中飾演女主角女鬼小芙蓉，人氣再度上升，可惜最終未能取得視后獎項。
1998年周海媚過檔亞視，主演《縱橫四海》、《影城大亨》及《縱橫天下》；《縱橫四海》更打破慣性收視，令本港台於黃金時段的收視率逼近至翡翠台。
2008年，周海媚以外援身份回巢無綫，至2014年再次約滿TVB，專注在內地發展。同年她在《武媚娘傳奇》飾演的楊淑妃一角備受好評，人氣再度攀升。2019年，周海媚在新版《倚天屠龍記》中飾演滅絕師太，由「最美周芷若」變身「最美滅絕師太」，為網民津津樂道。
周海媚曾經有過一段婚，1988年她與呂良偉在美國拉斯維加斯秘密註冊結婚，但婚姻只維持短暫的一年。2010年她受訪內地節目，講述與建築師男友戀情，已決定不婚不育，至2015年她在台北受訪，表示這段12年戀情已結束。
TVB亦回應周海媚離世消息：「前無綫藝員周海媚因病離世，無綫電視深表惋惜，並向其家人致以深切慰問。周海媚曾效力無綫多年，拍攝過多部劇集，包括《流氓大亨》、《赤腳紳士》、《義不容情》、《今生無悔》、《倚天屠龍記》、《情濃大地》等，其後演出《大鬧廣昌隆》一劇，人氣急升，演技大受讚賞。好戲之人離世，實在值得觀眾永遠懷念！」
